uitdagingen in rna-extractie

Gids voor het oplossen van problemen met Total RNA-extractie & Zuivering

1. Wat veroorzaakt RNA-afbraak?
2. Hoe kan RNA-extractie worden verbeterd??
3. Waarom is RNA moeilijker te extraheren dan DNA?
4. Hoe kun je DNA-besmetting voorkomen tijdens RNA-isolatie?
5. Hoe kunnen we RNA beschermen tegen afbraak??
6. Vernietigt autoclaveren RNA?
7. Hoe vries je cellen in voor RNA-extractie?
8. Hoe kom je van RNA af??
9. Hoe werkt RNA-extractie??
10. Waarom vloeibare stikstof wordt gebruikt bij RNA-extractie?
11. Wat is het doel van RNA-extractie?
12. Wat is een goede RNA-opbrengst?

Wat veroorzaakt RNA-afbraak?

Er zijn twee belangrijke redenen voor RNA-afbraak tijdens RNA-analyse. Ten eerste is RNA door zijn structuur inherent zwakker dan DNA. ... Dit maakt RNA chemisch labieler dan DNA. RNA is ook vatbaarder voor warmteafbraak dan DNA.

Hoe kan RNA-extractie worden verbeterd??

Er zijn 3 effectieve methoden om dit te bereiken:

1. Homogeniseer monsters grondig onmiddellijk na het oogsten in een chaotrope cellysisoplossing (die bijvoorbeeld guanidinium bevat), zoals de lysisbuffer die beschikbaar is in de PureLink RNA Mini Kit of TRIzol Reagent.
2. Vries monsters in vloeibare stikstof snel in.

Waarom is RNA moeilijker te extraheren dan DNA?

De belangrijkste reden is dat RNA minder stabiel en gemakkelijker af te breken is in vergelijking met DNA. ... RNA heeft grotere groeven dan DNA, waardoor het gemakkelijker wordt om aangevallen te worden door enzymen. Enzymen die RNA afbreken, ribonucleasen (RNases) zijn overvloedig aanwezig in de omgeving en moeilijk volledig te verwijderen.

Hoe kun je DNA-besmetting voorkomen tijdens RNA-isolatie?

Het probleem kan soms worden vermeden door primers te beperken om introngrenzen te overschrijden, maar dit is vaak moeilijk en methoden die momenteel worden gebruikt om DNA-besmetting te verminderen, zijn onder meer DNAse I-vertering, gelfractionering, zuurfenol: extractie met chloroform en precipitatie met lithiumchloride.

Hoe kunnen we RNA beschermen tegen afbraak??

Om afbraak te voorkomen, worden RNA-monsters over het algemeen ingevroren bewaard bij -20 ° C of -80 ° C of onder vloeibare stikstof.

Vernietigt autoclaveren RNA?

Zorg ervoor dat u de reagentia die voor RNA-werk worden gebruikt, scheidt van "reagentia voor algemeen gebruik" in het laboratorium. Alle oplossingen, behalve Tris-buffers, moeten een nacht bij kamertemperatuur worden behandeld met 0,1% DEPC (of DMPC) en vervolgens worden geautoclaveerd. Autoclaveren hydrolyseert en vernietigt niet-gereageerd DEPC en DMPC.

Hoe vries je cellen in voor RNA-extractie?

Plaats weefsel in een 1,5 ml microfugebuisje of 15 ml conisch en klik in de vriezer op droogijs. U kunt het weefsel ook in aluminiumfolie wikkelen en invriezen met vloeibare stikstof.

Hoe kom je van RNA af??

RNA-besmetting kan worden verwijderd door 2 microliter RNase A (10 mg / ml, Fermentas) toe te voegen aan 20 microliter DNA opgelost in TE-buffer (Tris-EDTA, pH = 8,0) en gedurende 3-4 uur bij 37 ° C te incuberen.

Hoe werkt RNA-extractie??

Organische extractiemethoden

Tijdens centrifugeren wordt het monster in drie fasen gescheiden: een onderste organische fase, een middelste fase die gedenatureerde eiwitten en gDNA bevat, en een bovenste waterige fase die RNA bevat. De bovenste waterfase wordt gewonnen en RNA wordt verzameld door alcoholprecipitatie en rehydratatie.

Waarom vloeibare stikstof wordt gebruikt bij RNA-extractie?

Vloeibare stikstof wordt gebruikt omdat het een zeer lage temperatuur heeft van -176 ° C die helpt om de harde substantie van plantaardig en dierlijk weefsel te verpulveren tot stof. Het helpt ook bij het deactiveren van de DNAase om het DNA te verteren .

Wat is het doel van RNA-extractie?

RNA-extractie is de zuivering van RNA uit biologische monsters. Deze procedure wordt bemoeilijkt door de alomtegenwoordige aanwezigheid van ribonuclease-enzymen in cellen en weefsels, die RNA snel kunnen afbreken.

Wat is een goede RNA-opbrengst?

Een A₂₆₀/EEN₂₈₀ ratio groter dan 1,8 wordt gewoonlijk beschouwd als een aanvaardbare indicator van RNA van goede kwaliteit met een laag niveau van eiwitverontreiniging [14, 15]. Een A₂₆₀/EEN₂₃₀ ratio hoger dan 1,8 wordt gebruikt als een indicator van geëxtraheerd RNA met een laag gehalte aan polysaccharidenverontreiniging.