succesvolle dubbele digest

1. Wat is een dubbele restrictie-samenvatting??
2. Wat is enkelvoudige spijsvertering en dubbele spijsvertering?
3. Hoe lang moet een restrictie-overzicht duren?
4. Waarom zijn er twee banden in het verteerde monster??
5. Waarom werkt mijn beperkingsoverzicht niet??
6. Hoe kunnen we beperkende spijsvertering voorkomen?
7. Zijn DNA-fragmenten positief of negatief?
8. Wat is een elektroforese met dubbele vertering?
9. Wat betekent het om DNA te verteren??
10. Wat gebeurt er als u teveel restrictie-enzym toevoegt??
11. Kan ik een restrictiesamenvatting opslaan?
12. Hoe bereken je restrictiesamenvatting?

Wat is een dubbele restrictie-samenvatting??

Double Digests. Het gelijktijdig verteren van een DNA-substraat met twee restrictie-endonucleasen (dubbele vertering) is een veelgebruikte tijdbesparende procedure. ... De prestatiegrafiek voor restrictie-enzymen beoordeelt het percentage activiteit van elk restrictie-endonuclease in de vier standaard NEBuffers.

Wat is enkelvoudige spijsvertering en dubbele spijsvertering?

Enkelvoudig digest: slechts één restrictie-enzym. Double digest: twee restrictie-enzymen.

Hoe lang moet een restrictie-overzicht duren?

* Pro-Tip * Afhankelijk van de toepassing en de hoeveelheid DNA in de reactie, kan de incubatietijd variëren van 45 minuten tot 's nachts. Voor diagnostische digesties is 1-2 uur vaak voldoende. Voor verteringen met >1 µg DNA gebruikt voor het klonen, het wordt aanbevolen om minimaal 4 uur te verteren.

Waarom zijn er twee banden in het verteerde monster??

De twee extra banden zijn waarschijnlijk geen ongesneden plasmidevormen (ik gebruik er ongesneden plasmide-DNA naast) en zijn kleiner dan de verwachte band. De omstandigheden, componenten en de concentratie ervan in de tweede reactie waren dezelfde als in de eerste.

Waarom werkt mijn beperkingsoverzicht niet??

Onvolledige of geen spijsvertering vanwege enzymactiviteit geblokkeerd door DNA-methylering. Als uw enzym actief is en het controle-DNA verteert en de reactie onder optimale omstandigheden wordt opgezet, maar u nog steeds problemen met de spijsvertering ziet, kan het zijn dat het enzym wordt geremd door methylering van het template-DNA..

Hoe kunnen we beperkende spijsvertering voorkomen?

Als verdere manipulaties van het verteerde DNA vereist zijn, is warmte-inactivering (verhoging van de temperatuur tot 65 of 80 ° C gedurende 20 minuten) de eenvoudigste methode om een ​​reactie te stoppen.

Zijn DNA-fragmenten positief of negatief?

DNA-fragmenten zijn negatief geladen, dus bewegen ze naar de positieve elektrode. Omdat alle DNA-fragmenten dezelfde hoeveelheid lading per massa hebben, bewegen kleine fragmenten sneller door de gel dan grote.

Wat is een elektroforese met dubbele vertering?

Een dubbele vertering is er een waarbij twee restrictie-enzymen worden gebruikt om DNA in een enkele reactie te verteren. In dit geval gebruikt u EcoR I en BamH I. Er is slechts één site in de plasmidevector voor elk van deze enzymen en ze bevinden zich aan weerszijden van uw insert-DNA..

Wat betekent het om DNA te verteren??

Experiment 1: Beperkende spijsvertering

Restrictie-spijsvertering is het proces waarbij DNA-moleculen in kleinere stukjes worden gesneden met speciale enzymen die restrictie-endonucleasen worden genoemd (soms gewoon restrictie-enzymen of RE's genoemd).

Wat gebeurt er als u teveel restrictie-enzym toevoegt??

Onvolledige vertering kan optreden als er te veel of te weinig enzym wordt gebruikt. De aanwezigheid van contaminanten in het DNA-monster kan de enzymen remmen, wat ook resulteert in een onvolledige vertering.

Kan ik een restrictiesamenvatting opslaan?

Het product van restrictiedigestie kan gemakkelijk worden bewaard bij -20 C.Bij 4 C zou het prima zijn, maar om er zeker van te zijn dat er geen activiteit en geen steractiviteit is, wordt het aanbevolen om het op -20 C te houden.

Hoe bereken je restrictiesamenvatting?

Bereken de hoeveelheid van elk die u aan een restrictiedigestie moet toevoegen om 5 µg (5000 ng) DNA te verteren met 5 eenheden enzym. Als mijn DNA bijvoorbeeld 190 ng / ul is, heb ik nodig: 5000 ng / 190 ng / ul = 26 ul van mijn monster.