Differbetween
- Waarom zijn er dubbele verteringsbeperkingen??
- Waarom werkt mijn beperkingsoverzicht niet??
- Wat gebeurt er als u teveel restrictie-enzym toevoegt??
- Kunnen twee restrictie-enzymen op dezelfde plaats snijden?
- Hoe bereken je restrictiesamenvatting?
- Hoe lang moet een restrictie-overzicht duren?
- Is warmte-inactivering van restrictie-enzymen noodzakelijk?
- Vervallen restrictie-enzymen?
- Hoe kan restrictie-digest worden voorkomen?
- Waarom zou een restrictie-enzym niet snijden??
- Hoe selecteer je restrictie-enzymen?
- Waarom moeten restrictie-enzymen op ijs worden bewaard??
Waarom zijn er dubbele verteringsbeperkingen??
Het gelijktijdig verteren van een DNA-substraat met twee restrictie-endonucleasen (dubbele vertering) is een veelgebruikte tijdbesparende procedure. Het selecteren van de beste NEBuffer om reactiecondities te bieden die de enzymactiviteit optimaliseren en om steractiviteit geassocieerd met sommige enzymen te vermijden, is een belangrijke overweging.
Waarom werkt mijn beperkingsoverzicht niet??
Onvolledige of geen spijsvertering vanwege enzymactiviteit geblokkeerd door DNA-methylering. Als uw enzym actief is en het controle-DNA verteert en de reactie onder optimale omstandigheden wordt opgezet, maar u nog steeds problemen met de spijsvertering ziet, kan het zijn dat het enzym wordt geremd door methylering van het template-DNA..
Wat gebeurt er als u teveel restrictie-enzym toevoegt??
Onvolledige vertering kan optreden als er te veel of te weinig enzym wordt gebruikt. De aanwezigheid van contaminanten in het DNA-monster kan de enzymen remmen, wat ook resulteert in een onvolledige vertering.
Kunnen twee restrictie-enzymen op dezelfde plaats snijden?
U kunt het doen met de juiste controles, zoals de spijsvertering met enkele beperking en beide enzymen samen om ervoor te zorgen dat beide onafhankelijk en ook samen snijden en uw plannen voortzetten. Helaas was ik beperkt tot deze twee enzymen die toevallig sites naast elkaar hadden!
Hoe bereken je restrictiesamenvatting?
Bereken de hoeveelheid van elk die u aan een restrictiedigestie moet toevoegen om 5 µg (5000 ng) DNA te verteren met 5 eenheden enzym. Als mijn DNA bijvoorbeeld 190 ng / ul is, heb ik nodig: 5000 ng / 190 ng / ul = 26 ul van mijn monster.
Hoe lang moet een restrictie-overzicht duren?
* Pro-Tip * Afhankelijk van de toepassing en de hoeveelheid DNA in de reactie, kan de incubatietijd variëren van 45 minuten tot 's nachts. Voor diagnostische digesties is 1-2 uur vaak voldoende. Voor verteringen met >1 µg DNA gebruikt voor het klonen, het wordt aanbevolen om minimaal 4 uur te verteren.
Is warmte-inactivering van restrictie-enzymen noodzakelijk?
FAQ: Is het nodig om restrictie-enzymen na vectorvertering te inactiveren? Inactivering van restrictie-endonucleasen is in het algemeen niet nodig, maar kan in sommige gevallen de transformatie-efficiëntie verhogen.
Vervallen restrictie-enzymen?
Alle enzymen worden elke 3-6 maanden op activiteit getest; de vervaldatum staat vermeld op het etiket dat aan elke injectieflacon met enzym is bevestigd. Na vijfendertig jaar ervaring met restrictie-enzymen hebben we ontdekt dat de meeste zeer stabiel zijn wanneer ze bij -20 ° C worden bewaard in de aanbevolen opslagbuffer..
Hoe kan de vertering van beperkingen worden voorkomen?
Restrictie Enzyme Digest Protocol
- Voeg componenten toe aan een schone buis in de aangegeven volgorde: ...
- Incubeer de reactie gedurende 1 uur bij ontsluitingstemperatuur (gewoonlijk 37 ° C).
- Stop de vertering door warmte-inactivering (65 ° C gedurende 15 minuten) of toevoeging van 10 mM eindconcentratie EDTA.
- Het verteerde DNA is klaar voor gebruik in onderzoekstoepassingen.
Waarom zou een restrictie-enzym niet snijden??
FAQ: Waarom knipt mijn restrictie-enzym geen DNA? ... Als het controle-DNA wordt gesplitst en het experimentele DNA splitsing weerstaat, kunnen de twee DNA's worden gemengd om te bepalen of er een remmer in het experimentele monster aanwezig is. Als een remmer (vaak zout, EDTA of fenol) aanwezig is, zal het controle-DNA na menging niet knippen.
Hoe selecteer je restrictie-enzymen?
Wanneer u restrictie-enzymen selecteert, wilt u enzymen kiezen die:
- Flankeer uw insert, maar snijd niet in uw insert.
- Bevinden zich op de gewenste locatie in uw ontvangende plasmide (meestal in de Multiple Cloning Site (MCS)), maar knip niet ergens anders op het plasmide.
Waarom moeten restrictie-enzymen op ijs worden bewaard??
Moeten enzymen echt altijd op ijs worden bewaard? ... Enzymen moeten worden opgeslagen en gebruikt bij hun optimale temperaturen. Enzymen worden over het algemeen opgeslagen in glycerol bij -20C. Dit voorkomt dat ze volledig bevriezen, wat denaturatie van eiwitten veroorzaakt en resulteert in een verlies aan activiteit.
